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Processo fermentativo com dois substratos

É muito comum encontrarmos na literatura, trabalhos que utilizam modelos cinéticos não estruturados, onde consideram como substrato limitante a fonte de carbono e esta sendo única e geralmente a glicose. Quando do inicio dos trabalhos da minha tese de doutorado, no início dos anos 90 e até os dias atuais, o resultado de concentração de substrato nas dornas de fermentação vem expresso em ART (açúcares redutores totais). Sendo assim, inicialmente adaptei estes modelos para as condições das nossas destilarias e iniciei os trabalhos de modelagem utilizando a concentração de ART como substrato.

Na realização dos experimentos, quando do ajuste do modelo, foram observadas algumas incoerências com relação aos valores dos parâmetros cinéticos obtidos e seu significado físico. Como exemplo mais significativo destas incoerências temos o valor do parâmetro Ks, vinculado a limitação pelo substrato, ser maior que o valor do parâmetro Ki, vinculado com a inibição pelo substrato. Primeiramente, achei que a rotina de ajuste que utilizei para determinar o conjunto de parâmetros estava convergindo para regiões de falso mínimo e provocando as incoerências nos valores destes dois parâmetros.

Esta dúvida persistiu até que começamos a utilizar cromatografia líquida para análise da concentração de substrato presente no meio fermentativo. A Tabela 01 mostra o perfil de açúcares, etanol e glicerol de uma fermentação industrial, operando em batelada alimentada, utilizada para produção de aguardente. Estas fermentações são realizadas com menor quantidade de inoculo, o que a torna mais lenta quando comparada àquelas utilizadas para produção de álcool carburante ou anidro.

Tempo

(h)

Sacarose (g/L)

Glicose (g/L)

Frutose (g/L)

ART

(g/L)

Glicerol (g/L)

Etanol (g/L)

0

0

0

0

0

0,84

16,58

1

0

28,24

31,98

62,67

1,13

11,36

2

0

36,12

45,05

81,18

2,05

17,36

3

0

40,26

50,81

91,07

2,16

16,65

4

0

40,26

53,72

93,99

2,39

20,30

5

0

32,49

49,41

81,91

2,58

22,57

6

0

24,97

42,53

67,50

2,44

27,40

7

0

16,60

35,98

52,59

2,76

29,75

8

0

11,23

28,42

39,65

3,19

36,72

Mosto

160,01

7,40

7,74

183,58

-

-

Algumas informações contidas nesta tabela são extremamente importantes para quem trabalha com cinética de fermentação alcoólica que utiliza como substrato caldo ou melaço de cana de cana de açúcar, onde o carboidrato em maior concentração é a sacarose. Estas informações são:

- A hidrólise da sacarose, promovida pela invertase presente no fermento utilizado como inoculo, é muito rápida mantendo a concentração de sacarose próxima de zero durante todo o tempo de enchimento da dorna. Este fato mostra que a reação de hidrólise não é a etapa limitante da produção de etanol nos processos industriais operando em batelada alimentada.

- Observa-se um aumento da concentração de glicose e frutose no meio. Produtos da hidrólise da sacarose, estes açúcares acumulam no meio de fermentação por serem gerados mais rapidamente que consumidos. Este fato mostra que a etapa limitante na produção de etanol é a conversão da glicose e frutose neste produto. Sendo assim, os estudos cinéticos devem ser direcionados para esta etapa do processo.

- A presença de glicose e frutose no meio de fermentação, em concentrações diferentes, mostra que as velocidades de consumo destes dois açúcares diferem entre si, sendo assim, deve-se ter um modelo cinético para cada açúcar, ou seja, temos agora um processo fermentativo com dois substratos.

Sobre o fato de se ter diferenças de concentração de glicose e frutose no meio, em primeira análise, pensou-se em se tratar do fenômeno de diauxia, onde o microrganismo tem preferência por um substrato e consome-o totalmente antes de iniciar o consumo de outro substrato presente no meio cuja afinidade com o microrganismo é menor. No entanto, utilizando os dados obtidos em ensaios industriais e de laboratório, notou-se que o consumo da glicose e frutose ocorre concomitantemente, diferindo somente na velocidade.

Este fato indica que a diferença de velocidade de consumo está correlacionada à velocidade de transporte destes substratos para o interior das células através da membrana celular e que por algum motivo, a glicose é favorecida em detrimento à frutose.

Baseado nestas observações foi elaborado os modelos cinéticos não estruturados que são utilizados atualmente por nós para descrever o comportamento do processo fermentativo. Estes modelos são baseados nos termos de limitação e inibição pelo substrato, inibição pelo produto e concentração celular e estão descritos abaixo nas equações 1 e 2 para glicose e frutose respectivamente.

Equação 01:

Equação 02:

Observa-se no modelo cinético onde a frutose é utilizada como substrato que existe um termo que relaciona a redução da velocidade de seu consumo em função da relação entre a concentração de glicose e a sua própria no meio fermentativo.

Com base nestas informações, não é de se esperar problemas de velocidade de fermentação devido a baixa velocidade de hidrólise da sacarose, mostrando que é desnecessário a utilização de enzimas para auxiliar neste processo. Além disto, mesmo linhagens industriais que possuam uma baixa produção de invertase não são problemas para unidades que operam com batelada alimentada, já que neste tipo de processo a quantidade de células no inoculo é muito grande em relação ao mosto alimentado. Desta forma, a quantidade de enzima presente no fermento tratado é suficiente para realizar a hidrolise da sacarose alimentada em às dornas com velocidade suficientemente elevada para não se tornar a etapa limitante do processo.

Da mesma forma, podemos esperar que os açúcares residuais no vinho fermentado seja na sua maioria frutose.

Outros estudos vem sendo realizados no momento com objetivo de determinar se o consumo de um ou outro açúcar leva a diferenças significativas no comportamento da levedura. Este ponto é importante, pois, no final da fermentação somente a frutose estará presente.

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