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Estimativa da taxa de morte celular em processos de fermentação alcóolica tipo batelada simples com alta concentração de células

Estimativa da taxa de morte celular em processos de fermentação alcóolica tipo batelada simples com alta concentração de células

1Leite, L.M.F. & 2Andrietta, S.R.

1 Usina São João de Araras. E-mail: lorena.leite@usj.com.br

2 Biocontal - Tecnologia em Bioprocessos. E-mail: sr.andrietta@gmail.com

1. Resumo

Foram corridos 2 ensaios de fermentação alcoólica em biorreatores de bancada com volume total de 6 L. Para o ensaio IN01, o inóculo utilizado foi obtido de uma massa de fermento comercial liofilizado, o qual passou por um processo de hidratação e posteriormente utilizado no ensaio. Para o ensaio IN02, o inóculo foi obtido pela diluição de creme de levedura fresco proveniente de uma unidade industrial. O meio de cultivo utilizado foi um meio sintético composto de sacarose, extrato de levedura e sais minerais. Amostras foram retiradas em intervalos de uma hora e delas analisado as concentrações de sacarose, glicose, frutose, ART, etanol, glicerol e massa celular em base seca. Os dados foram utilizados para determinar os rendimentos em etanol e células. Os resultados mostraram a existência de duas fases de comportamento distinto no decorrer do ensaio, uma de alta velocidade de conversão e outra de baixa velocidade de conversão. Foram determinados os rendimentos em etanol e células destas duas fases e comparadas entre si para os dois ensaios realizados. O ensaio corrido com células não adaptadas ao processo fermentativo (IN01) mostrou diferença mais acentuada no comportamento das duas fases quando comparado com o ensaio realizado com células adaptadas ao processo fermentativo. Para o rendimento fermentativo, as diferenças encontradas foram pequenas e podem ser explicadas pela diferença de concentração de etanol dentro e fora das células ocorrida principalmente na primeira fase de cultivo onde a velocidade de conversão é rápida. Para o rendimento em células, as diferenças foram muito significativa e somente explicadas pelo aumento da taxa de morte celular na fase II de cultivo, onde a presença de etanol em alta concentração, falta de substrato e esgotamento nutricional do meio fizeram com que o equivalente a 60% da massa células produzida nesta fase morressem e sofressem autólise para o ensaio com o inóculo IN01 e 40% para o ensaio com o inóculo IN02.

 

2. Introdução

Determinar a quantidade de células produzida durante o processo de fermentação alcoólica industrial com reciclo de célula é uma tarefa difícil devido a complexidade do processo e da representatividade das amostras coletadas. De uma forma geral, este parâmetro é estimado através da quantidade de células perdida pelo vinho centrifugado, determinada pela concentração de células contida na dorna volante (tanque pulmão de vinho dos aparelhos de destilação). Este número é pouco exato e não leva em consideração outras perdas e a taxa de morte das células de levedura no decorrer do processo fermentativo. Geralmente, a quantidade de massa celular excedente no processo somente tem relevância quando se utiliza o método de rendimento fermentativo por subproduto ou quando se pretende sangrar este excesso para produção de levedura seca utilizada como ração animal. No entanto, entender a dinâmica desta taxa de morte e seu efeito na cinética de conversão dos açúcares em etanol é de fundamental importância para se poder descrever adequadamente o comportamento do processo fermentativo, facilitando assim, a correção de problemas que possam vir a ocorrer ao longo da safra.

Com base nas rotas metabólicas envolvidas no catabolismo das hexoses (glicose e frutose) nas células de levedura em anaerobiose, como mostra a Figura 1 e 2, pode-se afirmar que a produção de etanol está vinculada à rota metabólica de produção de energia das células, pois, sem produzir etanol, nestas condições as células de levedura não são capazes de regenerar o NAD utilizado na oxidação do gliceraldeido-3P para chegar até piruvato, deixando de produzir 2 ATP, ou seja, não produzindo energia.

Figura 1. Metabolismo anaeróbico da glicose e frutose (Glicolise)

Figura 2. Fermentação alcoólica

Desta forma, o etanol pode ser considerado um metabólico primário e sua produção está vinculada com o crescimento celular, já que boa parte da energia obtida no catabolismo das hexoses é utilizada para sínteses de moléculas, ou seja, para reprodução e manutenção das células. Sendo assim, é de se esperar que a relação entre o etanol e a massa de célula produzida permaneça constante ao longo do processo, se a taxa de morte celular for próxima de zero. Com base neste conceito, elaborou-se uma série de ensaios conduzidos em biorreatores de bancada que permiteiram a determinação dos rendimentos em células e etanol ao longo da fermentação. Desta forma pode-se avaliar o comportamento das células de levedura durante a fermentação para estes parâmetros

 

2. Materiais e métodos

3.1. Inóculo

Foram utilizados dois tipos de inóculos nos ensaios realizados. O primeiro inóculo, chamado de IN01, foi preparado com células de levedura comerciais liofilizadas. O segundo, chamado de IN02, foi preparado utilizando creme de levedura fresco proveniente de uma unidade de fermentação industrial.

3.1.1. Preparo do IN01

.Transferiu-se 800 mL de água destilada e aquecida a 38oC para um becker de 2 L, o qual foi mantido em agitação utilizando-se um agitador magnético.

. Ao Becker foi adicionado 120 g de células de levedura comercial liofilizada. O fermento foi adicionado lentamente para evitar formação de grumos.

. Após a hidratação de todo o fermento, ajustou-se o volume final do Becker para 1.200 mL.

. Esta suspensão de células contendo aproximadamente 100 g/L de matéria seca foi mantida agitada por 2 horas para garantir total hidratação do fermento.

3.1.2. Preparo IN02

. Transferiu-se para um Becker de 2.000L, 600 mL de creme fresco proveniente de uma unidade de fermentação industrial, contendo uma concentração de aproximadamente 200 gMS/L.

. A este Becker foi adicionado água até que o volume final de 1.200 mL.

. Esta suspensão de células contendo aproximadamente 100 g/L de matéria seca, foi mantida agitada por 1 hora.

3.2.Preparo do meio de fermentação

Utilizou-se meio de fermentação sintético a base de sacarose e extrato de levedura para os ensaios de ambos os inóculos.

. A um Becker de 5L foi adicionado 2.500 mL de água destilada aquecida a 45oC, mantida agitada por intermédio de um agitador magnético.

. Adicionou-se a este Becker: 912 g de sacarose, 28 g de extrato de levedura, 25 g de cloreto de amônio, 25 g de fosfato diácido de potássio, 4,8 g de sulfato de magnésio hepta hidratado e 5,0 g de cloreto de potássio.

. Após a completa solubilização de todos os componentes, adicionou-se água até a massa final de 4.800 g.

3.3. Ensaio de fermentação

Os ensaios de fermentação foram realizados em um biorreator de bancada de volume total de 6L.

. Ao biorreator, adicionou-se 1.000 mL de suspensão de células IN01 ou IN02, de acordo com o experimento a ser realizado.

. Ativou-se o sistema de agitação e controle de temperatura do biorreator ajustado para 34oC e esperou que a suspensão de células atingisse esta temperatura.

. Adicionou-se ao biorreator 4.000 mL de meio de cultivo com temperatura ajustada para valores próximos de 34oC. Ao adicionar o meio, iniciou-se a contagem de tempo de fermentação, sendo este ponto o tempo 0.

. Amostras do meio em fermentação foram recolhidas em intervalos de tempo de uma hora, deste a hora zero até o final do experimento.

3.4. Analises 

3.4.1. Preparo das amostras

. Um volume conhecido de amostra foi retirado do meio em fermentação e rapidamente transferidas para tubos de centrífuga e centrifugadas a 8.000 rpm por 5 minutos em centrífuga refrigerada.

. Após a centrifugação, o sobrenadante foi separado para análise cromatográfica e o precipitado utilizado para a determinação da massa seca (concentração de células).

3.4.2. Análise de massa seca contida no material em fermentação

. A massa seca contida no tubo de centrífuga, após a centrifugação e separação do sobrenadante foi submetida a três lavagens consecutivas para remoção de sólidos solúveis.

. O material lavado foi então transferido para placas previamente taradas.

. Estas foram levadas a uma estufa de secagem com circulação de ar a 60oC e deixadas secando até peso constante (aproximadamente 24h).

As placas secas foram então pesadas e a diferença de peso entre a placa seca com amostra e a placa vazia forneceu a massa seca presente na quantidade da amostra adicionada ao tubo de centrífuga no preparo da amostra. Como este valor é conhecido, foi determinada a concentração de massa seca na amostra de meio em fermentação em cada amostra recolhida.

3.4.3. Análise de sacarose, glicose, frutose, glicerol e etanol no meio em fermentação

. O sobrenadante separado da massa seca no preparo da amostra foi então diluído com água desmineralizada de forma que a concentração de seus componentes ficasse dentro da faixa abrangida pela curva padrão de cada um deles.

. Após diluídas, as amostras foram filtradas em membrana de 0,22µm e acondicionados no injetor automático do cromatógrafo.

. As análises foram realizadas por cromatografia líquida com detectores de índice de refração.

 

4. Discussão de resultados

A Tabela 1 e 2 mostram respectivamente as concentrações de sacarose, glicose, frutose, ART, glicerol, etanol e massa celular base seca dos experimentos corridos com os inóculos IN01 e IN02.

Tabela 1. Resultados das concentrações de sacarose, glicose, frutose, ART, glicerol, etanol e massa celular em base seca, em função do tempo de fermentação utilizando o inóculo IN01

 Tabela 2. Resultados das concentrações de sacarose, glicose, frutose, ART, glicerol, etanol e massa celular em base seca, em função do tempo de fermentação utilizando o inóculo IN02

 

Observa-se pelos dados contidos nas Tabelas 1 e 2 que a sacarose foi totalmente convertida em glicose e frutose logo no início da fermentação, mostrando que a etapa de hidrólise da sacarose para processos de alta concentração de células não é uma etapa limitante da cinética de conversão. Isto somente ocorrerá se houver problema de inibição desta enzima.

Nota-se ainda que a velocidade de consumo de glicose foi maior que o da frutose, mas as duas hexoses foram consumidas concomitantemente, não caracterizando, portanto, um processo de diauxia. Como visto na Figura 1, os caminhos metabólicos para a conversão da glicose e frutose em duas moléculas de glirecaldeido 3P são diferentes. Assim, esta diferença de velocidade de consumo entre estas duas hexoses podem estar ligadas a diferença de afinidade de cada molécula com o transportador de hexose da membrana ou devido a menor velocidade de conversão da frutose em gliceraldeído 3P quando comparado com a da glicose.

A Figura 3 mostra os perfis de aparecimento de etanol e massa celular em função do tempo de fermentação nos ensaios com inóculo IN01 e IN02 respectivamente.

Figura 3. Perfil de concentração de etanol e massa celular para os ensaios com os inóculos IN01 e IN02

Observa-se por estas figuras que a concentração de etanol na hora zero do experimento com inóculo IN02 é diferente de zero, pois, este inóculo foi obtido do creme industrial o qual possui etanol em sua composição. A massa celular no tempo zero também foi maior para o ensaio com inóculo IN02, o que pode ter ajuda na diminuição do tempo de fermentação deste ensaio. Mesmo com estas diferenças no ponto inicial, nota-se pelos perfis contidos na Figura 3 que os comportamentos das fermentações são distintos entre si. Este fato mostra que existe diferenças significativas entre o comportamento de um inóculo composto por células já adaptadas ao processo de fermentação e outro por células liofilizadas.

Os perfis contidos na Figura 3 mostram que as fermentações corridas em batelada simples apresentam duas fases distintas, sendo estas mais evidentes quando se observa os perfis de produção de massa celular, onde uma fase de maior incremento ocorre no intervalo de tempo entre 1 a 4 horas, seguido por uma fase de menor incremento observado na faixa de tempo de 5 a 9 horas. Assim, as determinações de rendimento em etanol e massa celular serão feitos para o tempo total de fermentação e para estes dois períodos separadamente para confirmar a estabilidade destes parâmetros ao longo da fermentação.

Para determinar os rendimentos (Yp/s e Yx/s) nestes ensaios utilizou-se o método gráfico, onde se correlaciona as concentrações dos produtos e substratos em uma regressão linear

As Figuras 4 e 5 mostram os resultados de rendimento em etanol (Yp/s) global, para a primeira fase (fase I) e segunda fase (fase II) para os ensaios com inóculos IN01 e IN02 respectivamente.

 Figura 04. Rendimento em etanol global (a), primeira fase (b) e segunda fase (c) para o ensaio utilizando o inóculo UN01.

Figura 05. Rendimento em etanol global (a), primeira fase (b) e segunda fase (c) para o ensaio utilizando o inóculo UN02.

Nas Figuras 4 e 5, onde foi determinado o rendimento em etanol, as concentrações de etanol e de ART (açúcares redutores totais), correspondentes a cada tempo de fermentação analisado, foram plotadas no eixo Y e X respectivamente. Em seguida foi feita uma regressão linear entre estes pontos e encontrado a equação linear de cada fase analisada. O valor da inclinação da reta, que corresponde a tangente do ângulo de inclinação (concentração de etanol / concentração de ART) corresponde ao valor de Yp/s ou rendimento em etanol e o termo independente corresponde ao valor final de concentração de etanol obtido no ensaio pela regressão.

Nota-se pelos dados contidos nestas figuras que para todas as fases analisadas o coeficiente de correlação (r2) mostrou-se muito próximo de 1, confirmando que os dados se ajustam muito bem a uma correlação linear.

A mesma metodologia foi aplicada para determinar os rendimentos em células para todas as fases analisadas nos ensaios realizados.

As Figuras 6 e 7 mostram os resultados de rendimento em células (Yx/s) global, para a primeira fase (fase I) e segunda fase (fase II), para os ensaios com inóculos IN01 e IN02 respectivamente.

Figura 06. Rendimento em células global, primeira fase e segunda fase para o ensaio utilizando o inóculo iN01.

Figura 07. Rendimento em células global, primeira fase e segunda fase para o ensaio utilizando o inóculo IN02.

Os dados contidos nas Figuras 6 e 7 mostram que diferentemente do ocorrido com o rendimento em etanol, estes dados não se ajustaram perfeitamente a regressão linear, principalmente nos ensaios realizados com o inóculo IN01.

A Tabela 3 mostra os resultados de rendimento em etanol (Yp/s) e rendimento em células (Yx/s) para todas as fases analisadas.

Tabela 3. Valores de rendimento em etanol e células para todas as fases avaliadas.

Pelos dados contidos na Tabela 3 pode-se afirmar que o rendimento em etanol global obtido para os ensaios com inóculo IN01 e IN02 foram muito similares. No entanto, quando se analisa as duas fases separadamente nota-se uma diferença nos valores de rendimento em etanol entre estas. Esta diferença pode estar associada ao fato de que na fase I onde a velocidade de produção de etanol é muito intensa, a concentração deste produto no interior das células seja maior que no meio em fermentação, devido a velocidade com que ele deixa às células. Assim, na verdade, valores menores de rendimento na fase de maior velocidade de conversão é compensada por rendimentos maiores nas fases de menor velocidade de conversão, pois, nesta fase menos etanol é produzido e as concentrações dentro e fora das células deste produto tendem a se igualar. Este fato pode ser confirmado pelos resultados obtidos na fase II do ensaio realizado com o inóculo IN01 (0,4958 gEt/gART), valor este impossível de ser atingido. Outro ponto que pode corroborar com esta hipótese é o fato de as maiores diferenças neste parâmetro ter sido observada no ensaio onde células não adaptadas ao processo foram utilizadas. É possível que a membrana celular destas células apresente uma maior resistência para saída do etanol da célula para o meio.

Os resultados para o rendimento em célula, diferente dos apresentados pelo rendimento em etanol, apresentaram diferenças muito significativa entre a fase I e II de cada ensaio. Esta diferença ficou ainda maior quando células não adaptadas ao processo fermentativo foram utilizadas (inóculo IN01). Além disto, foi observado uma diferença significativa nos valores de rendimento em massa celular entre as fases I dos dois ensaios realizados. As células adaptadas ao processo fermentativo (IN02) apresentaram um rendimento em massa celular bem maior que aqueles apresentados pelas células não adaptadas ao processo (IN01)

A Tabela 4 mostra estas diferenças entre os rendimentos observados na fase I e II de cada ensaio.

Tabela 4. Diferenças entre os rendimentos em etanol e células para os ensaios com inóculo IN01 e IN02

Observa-se pelos dados contidos na Tabela 4 que a diferença entre os rendimentos em etanol obtidos na fase I e II de ambos ensaios são pequenas e podem estar associadas à diferença de concentração de etanol dentro e fora da célula devido a velocidade de saída deste produto das células. Além disto, o resultado global mostrou um bom ajuste ao modelo linear, mostrando que este rendimento se mantém constante no decorrer do processo fermentativo.

Para o caso de rendimento celular, as diferenças observadas são significativas, diminuindo em mais de 60% da fase I para a fase II no ensaio realizado com células não adaptadas ao processo fermentativo (IN01) e mais de 40% no ensaio corrido com células adaptadas. Não existe razão aparente para que o rendimento em massa celular varie ao longo da fermentação, pois, a energia obtida pelo catabolismo das hexoses é a mesma. Sendo assim, o que pode explicar esta queda no rendimento em massa celular na fase II é a elevação da taxa de morte. As condições e alta concentração de etanol, baixa concentração de substrato e esgotamento nutricional do meio podem elevar a um aumento na taxa de morte, principalmente das células não adaptadas ao processo fermentativo. Considerando que as células de levedura, logo após a morte, tendem a se autolisar para liberar nutrientes para as demais células, estas não serão mais detectadas nas análises de matéria seca, diminuindo o acréscimo da massa celular no meio que por sua vez afeta negativamente o resultado do rendimento em células.

Caso seja considerado que a taxa de morte celular durante a fase I de cultivo é próxima de zero, pode-se afirmar que a taxa de morte celular na fase II de cultivo é 60% da massa de célula gerada neste período para células não adaptadas e 40% para células adaptadas, ou seja, para os ensaios com o inóculo IN01, na fase II de cultivo, a massa equivalente a 60% da massa de células geradas morrem e sofrem autólise e para o ensaio com o inóculo IN02 a massa equivalente a 40% das células geradas nesta fase morrem e sofrem autólise.

5. Conclusões

O inóculo composto por células anteriormente adaptadas ao processo de fermentação (IN02) apresentou melhor desempenho que o inóculo liofilizado não adaptado à fermentação (IN01). Com relação ao rendimento em etanol a diferença entre os valores obtidos nos dois ensaios com inóculos diferentes foi pequena, mas para os valores de  rendimento celular esta diferença foi muito mais significativa.

Foi observado uma diferença nos rendimentos em etanol e em células entre as fases I e II para ambos os ensaios utilizando inóculos diferentes. Em relação ao rendimento em etanol, as primeiras fases apresentaram menores rendimentos comparados às segundas fases, sendo que, o equilíbrio foi estabelecido nos rendimentos globais, os quais apresentaram similaridade entre os ensaios com os inóculos IN01 e IN02. Tal fato pode estar relacionado à velocidade de saída de etanol do interior da célula para o meio externo. Em relação ao rendimento celular, esta diferença foi mais expressiva, em especial no ensaio em que se utilizou o inóculo não adaptado ao processo, IN01. Esta diferença pode ser explicada pela morte celular devido às condições adversas no meio fermentativo, tais como alta concentração de etanol, baixa concentração de substrato e esgotamento nutricional.

De uma forma geral, os dados mostraram que o rendimento em etanol se manteve constante ao longo do processo fermentativo, como previsto teoricamente, apresentando pequenas diferenças entre as fases estudadas. O mesmo não foi observado para o rendimento em células, cujos valores apresentaram diferenças significativas entre as duas fases do processo fermentativo, sendo muito mais elevado na fase I que na fase II. Este fato mostra que a taxa de morte celular existe e afeta significativamente a quantidade de massa celular obtida e que esta taxa aumenta quando as condições do meio fermentativo se tornam mais restritivas. Este efeito é observado com maior intensidade quando se utiliza como inóculo células não adaptadas ao processo fermentativo. 

 

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